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早在唐代我国文学家段成式（公元？—
863）的随笔集《酉阳杂俎》中记载蜂虫草迄今已有近
1200年，目前全世界已报道的虫草有
400种以上，其中以冬虫夏草（
C（
rd y ce），，in
en，i，（
Be rk .）
Sa cc .）最为引人注目。我国古代民间就对冬虫夏草的药用价值有一定的认识，并将其与人参、鹿茸齐名为传统三大补品之一。据考证冬虫夏草最早出自《本草备要》（汪昂，1694）。《本草备要》载：“冬虫夏草，甘平，保肺益肾，止血化痰，己劳嗽。四川嘉定府所产者佳。”
冬虫夏草的药用，是以干燥的子座及虫体（包括菌核）一并入药，其中含有多种成分，除主要含有粗蛋白、脂肪、粗纤维、碳水化合物等物质外还含有其他一些具有生理活性的物质如：糖醇、甾醇类，多糖类，有机酸、氨基酸、核苷类等。现代医学研究表明，冬虫夏草具有增强巨噬细胞吞噬、提高机体免疫的功能，具一定的抗癌作用，对中枢神经系统具有镇静和催眠效果。此外，对肾脏、心脏、肝脏损伤有保护和防治作用，以及抗衰老、抗缺氧的应激作用，扩张冠状动脉、抗心律失常、降低心肌耗氧量及抗氧化等作用。正因为冬虫夏草具有多种医疗和滋补作用而从古至今都受到人们极大的关注，尤其是近几十年来，人们对冬虫夏草的生物学特性、培养与栽培、化学成分、药理作用及食疗应用等方面进行了深入的研究，并取得了可喜的成果，但研究开发中也存在一些问题。
1 冬虫夏草研究现状
1.1 冬虫夏草分类学研究
近些年，报道了外观与冬虫夏草相似的几个种，它们是甘肃虫草（
C . g a n，u
en，i，
Zh an g，
W an g e t Y an）（
Zh an g e t a l .，1989）、多枝虫草（
C . m u l t ia x a l i，
Zan g e t K in jo）、尼泊尔虫草（
C . n e）
a len，i，
Zan g e tK in jo）（
Zan g e t K in jo，1998）、阔孢虫草（
C . c r a，，i，－）（
r a Zan g，
Y an g e t L i）（
Zan g e t a l .，1990）和康定虫草（
C . k a n g d in g Zan g e t K in jo）。这些新报道的种与冬虫夏草之间是什么关系，有必要进行深入的研究，这关系到冬虫夏草的开发利用。人们从不同角度进行了研究。梁宗琦等从发育的角度研究提出了甘肃虫草可能是冬虫夏草的某一发育阶段；
K an g e t a l（2000）对甘肃虫草与冬虫夏草
5.8 rRNA基因及
ITDS 2间区
DNA序列的分析表明甘肃虫草与冬虫夏草的
DNA序列相同，属同一个种。
L iu e t a l .（2001）对尼泊尔虫草和多枝虫草进行了
ITS区段碱基序列分析，并采用了形态的、发育生理等多方面的研究，结果表明二者均为冬虫夏草的同物异名。刘作易（1999）对阔孢虫草和冬虫夏草的显微结构观察发现，虽然冬虫夏草成熟标本的显微结构大小随不同的研究者有所变化，然而子囊壳、子囊和子囊孢子的大小范围都覆盖了阔孢虫草，阔孢虫草的子囊大小为
170～
220μm×
7.5～
10.5μm，子囊孢子宽度为
5.2～
5.6μm，阔孢虫草与冬虫夏草的主要区别是前者的子囊孢子的隔细胞较短（6.5～
9.8μm×
5.2～
6.5μm），寄主为白马蝙蝠蛾
H e）
ia lu，
ba
im a en，i，L
ian g。人们对阔孢虫草独立于冬虫夏草提出质疑，要真正确立阔孢虫草的分类地位有必要从子囊孢子的动态发育过程及
DNA分子水平上加以研究确定，但目前尚未见到
DNA序列的报道。张云武（1999）利用
18个随机引物获得来自高黎贡山、玉龙雪山的冬虫夏草和来自德钦地区的阔孢虫草的
RAPD谱带多态性，遗传距离分析认为，冬虫夏草与阔孢虫草间存在显著差异。因此，冬虫夏草与阔孢虫草是
2个种，还是同一个种的不同地理群？这个问题还有待于利用更多适当的方法和依据去验证。同时，康定虫草也需进一步研究。
1.2 冬虫夏草子囊孢子发育研究
梁宗琦等将冬虫夏草子囊孢子的发育分为原子囊孢子期、子囊孢子伸长期和子囊孢子成熟期三个阶段，不同的时期子囊孢子的形态特征和大小存在明显的差别。在原子囊孢子期孢子近球形、椭圆形、卵圆形至长圆形；在孢子伸长期，原子囊孢子沿子囊长轴从孢子一端突出，伸长生长。在原子囊孢子伸长初期，大多数孢子败育，最终只形成
1个或
2个或
4个丝状子囊孢子，败育形成的孢子仍可见，刘作易等的研究也得到同样的结论。每个子囊里具有
1、
2、4、8个不同数目的子囊孢子，为什么出现这种差别？在微循环产孢观察时，为什么子囊孢子中有的细胞能够萌发，有的则不萌发？在此过程中是否有成套染色体？这一系列问题还有待于进一步从核型方面研究。
1.3 冬虫夏草的人工培育
由于天然的冬虫夏草有严格的寄生性及特殊的生长地理环境，因而产量有限，加上近年来采挖过度，资源破坏严重，价格昂贵。再有近年来生态环境的破坏，青藏高原温度上升，使冬虫夏草资源锐减，已濒临灭绝边缘，根本无法满足保健和用药的需求。很多学者和开发商都非常关注冬虫夏草资源的研究，有
3种途径可部分解决这一问题：一是利用无性型菌株进行菌丝体发酵，再从菌丝体中提取功能组分，但冬虫夏草的无性型中华被孢霉（
H ir，u
te l la，in
en，i，）是一种喜低温的慢生型真菌，其培养基的成分及最佳培养条件等有待于进一步研究，而且发酵需要的时间长，目前所报道的冬虫夏草菌丝发酵产品所用的菌皆非冬虫夏草的真正无性型中华被孢霉，而是一些从冬虫夏草上分离到的菌，如至灵胶囊的菌株为蝙蝠蛾被孢霉（
M（
r t ie r e l la！
e）
ia la）、金水宝胶囊的菌株为蝙蝠蛾拟青霉（
P a ec i l（
m y ce，！
e）
ia l i）；二是利用分子生物技术克隆编码这些功能物的基因，在其它生物体内表达和生产这些功能物质，但目前对冬虫夏草的大部分功能的物质基础尚未研究，因此，基因克隆也就无从谈起；三是人工栽培子实体。
显然，人工培养子实体是最理想的方法，目前国内外都在大力开展培育冬虫夏草的工作，虽然已经掌握了人工栽培的基本技术，但至今离产业化的实际要求尚有一些关键的科学和技术问题有待突破解决。沈南英等（1981，1983）通过子囊孢子、内菌核、子座及虫体外菌丝分离得的
35个菌株，于
23种培养基上进行了实验。其中有一个从虫体组织分离得的
H 1菌株，在营养成分丰富的
S 31培养基上，8～
17℃，室内见光培养，7个月后形成了具成熟子囊壳的虫草子实体。但迄今为止，仅此一例，尚未见到其它成功的报道。他们试验的结果显示，要成功培养出冬虫夏草子实体至少应考虑到下列因素：菌种必需用真正无性型阶段菌株（含无性孢子）或用成熟的天然的子囊孢子作为接种体；饲养繁殖寄主昆虫的技术；具备能满足虫与菌生理、生化要求独特的条件，使虫菌结合实现侵染寄生，以便长成虫草子实体。显然，菌种是一个关键性的条件，在自然野生状态下，虫草菌丝的生长力和繁殖产孢力是有效侵染寄主的两个重要因素，要实现人工侵染和冬虫夏草人工繁殖应下功夫探索促进产孢率的条件，因此，冬虫夏草培育成功，必须首先要培养出具有感染力的无性型孢子，同时如何检测分生孢子的质量和怎样才能生产出大量的孢子等问题，也是冬虫夏草的人工培育中存在和亟待解决的问题。
同时，冬虫夏草菌丝生长温度也是冬虫夏草培育中的一个制约因子。李玉玲（2001）通过对冬虫夏草菌丝体生长温度的试验结果表明：冬虫夏草菌株在
10℃、15℃、18℃、21℃、25℃等
5个温度梯度下能生长，但以
15℃下生长最快。菌丝生长的最适平均温度为
15℃，菌丝的适温范围在
15～
18℃。因此如何提高冬虫夏草菌丝生长温度对冬虫夏草培育具有重要的现实意义。
1.4 冬虫夏草的核型研究
由于冬虫夏草具有多种药效作用，所以人们较多关注它的直接开发利用，而对冬虫夏草核型研究相对较少。核型（
K a r y o ty p e）又叫染色体组型或基因组型，是指一个生物体、细胞器或病毒、真菌的整套基因。核型分析旨在解析基因组
DNA的数目、大小、结构等，是分子生物学乃至整个生命科学领域的一项重要的基础性工作，也是改良、培育优良新菌株的前提。众所周知，细胞核是生物遗传信息贮存、复制、表达的主要场所和生长发育的控制中心，它不仅影响生物种性，也影响生长过程的生理变化，对细胞核进行观察研究具有极其重要的意义。而冬虫夏草在这方面的相关报道甚少，对冬虫夏草研究到目前为止还不能确定究竟有多少条染色体？染色体的形状如何？其
DNA分子量是多少？在分裂过程中核是怎样变化的等问题。这些问题限制了对其染色体功能和行为的研究，同时这些又与冬虫夏草的分类学及开发利用等都有直接或间接的关系。
2 深入研究冬虫夏草的一些建议
2.1 荧光染色技术研究冬虫夏草发育规律
荧光染色技术和电子显微技术为研究冬虫夏草子囊孢子在生长发育过程中核的变化规律及染色体的形态提供了技术支持。实验证明，某些荧光素与真核生物细胞核内的
DNA有着亲和力，亲和后，可使细胞核内脱氧核糖核酸（
DNA）发生绿色的荧光，因此，可采用荧光染色剂对冬虫夏草的有性型的子囊孢子和无性型的菌丝及分生孢子进行生长、发育过程的观察，从细胞学水平研究冬虫夏草子囊孢子生长和发育规律。并结合超微结构技术即电子显微技术，通过对组织或发育过程的菌丝或孢子进行超微切片等处理，用电子显微镜观察核的变化过程和染色体行为。
2.2 脉冲场电泳技术研究冬虫夏草核型
细胞脱壁技术（原生质体制备技术
p r o to p la s t－
in g tech n o lo g y）和脉冲场电泳（
p u lsed－
f ie ld g e l e lec－
t r o p h o r e s is－
PFGE）技术的发展，使丝状真菌也能被用于电泳核型分析（
E lec t r o p h r e t ic k a r y o ty p e an a ly－
s is）。原生质体技术是近年来迅速发展起来的细胞工程育种新技术，包括原生质体的释放和再生，原生质体融合，原生质体单核化，原生质体无性系繁殖，原生质体巨大化以及由原生质体制备
DNA等。
细胞脱壁常用的方法有酶法处理法和机械法处理法，由于虫草菌细胞壁的结构及组成成分还不清楚，一般而言，真菌细胞壁的成分中应包括蛋白质、几丁质、纤维素等，可用工具酶木瓜蛋白酶、鸡蛋清溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶、溶菌酶、溶壁酶等进行处理；机械法常采用高压匀浆和超声波进行处理。有时为了达到更好的破壁溶菌效果，可将机械破壁与酶法溶菌相结合，采用高压均质和纤维素酶结合处理或超声波和纤维素酶结合均可达到很好的破壁溶菌效果。
真菌核分裂时观察不到染色体行为，同时其染色体很小，难以用核染色和杂交等方法进行核型分析，也难以用遗传学方法和细胞学方法测定其染色体数目和大小；同时其
DNA片段相对较大，不能用普通凝胶电泳完整地分析真菌
DNA。
80年代初期发展起来的
PFGE技术是被推荐用来分离真菌染色体
DNA以测定其染色体数目、大小及其进行核型分析的首选方法。利用
PFGE技术可获得显示真菌完整染色体
DNA数目与
DNA分子大小的谱带即分子核型。脉冲场电泳技术能够区分大小在
20～
1200 k b的
DNA分子，
PFGE技术利用交变电场使
DNA分子改变方向的时间依赖于分子的大小，分辨率由脉冲时间来决定，而且可以通过改造装置和实验方法提高分辨率。常用的方法是等压同源电场电泳，六角形排列的电极产生完全一致的电场，从而导致垂直电泳带和良好的分辨率。
Sh im izu等（1991）首次利用
PFGE技术研究了玖烟色拟青霉
P
a ec i l（
m y ce，
f um（，（
r（，en，的
DNA分子，在等压电场电泳中分辨出
6条染色体
DNA分子，其大小分别为
7.8、6.2、5.3、4.4、3.3和
3.1 M b。该技术也成功地分析了家蚕病原白僵菌的核型，从而说明该技术是很有价值的分子标记技术。因此，可以利用
PFGE技术进行冬虫夏草的核型分析，研究冬虫夏草染色体
DNA的数量及分子量大小，为将来虫草药物成分以及一些有效功能基因的定位打下基础。高锁状均质电场（
co n to u r c lam p ed h om o g en eo u se lec t r ic f ie ld，
CHEF）凝胶电泳技术的发展也极大地推动了各种真菌电泳核型的研究，在真菌染色体作图、基因定位和基因克隆中也有广阔的应用前景。该技术成功地用于香菇的核型分析和黑木耳电泳核型分析
刘永霞 1，刘作易 2（1.贵州大学生物技术学院真菌资源研究室，贵阳 550025；2.贵州省农业科学院，贵阳 550006）
文章来源：《贵州农业科学》
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